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　　miR-455通过调控钙网蛋白途径对短期和长期压力负荷诱导的心肌肥厚的影响.pdf

　　背景流行病学分析显示当今社会导致死亡的主要疾病主要为高血压，冠心病等心血管疾病，但随着医学技术与研究手段的发展，这方面的救治成功率得到了明显提高。虽然心血管病的致死率逐年降低，但它们最终的转归即慢性心力衰竭却呈现日益增加，因此救治慢性心力衰竭成为防治的重点。慢性心衰出现后心肌功能多受损，原因各有不同。慢心衰前期多会出现心肌肥厚，心肌肥厚又是导致慢性心衰的重要原因之一，二者互为因果。近年来在多种生命体内发现了一种新的小分子RNA，MICRORNAS，具有调节转录后的活性，更进一步又发现很多MICRORNAS与心肌肥厚密切相关。MICRORNAS若要发挥生物学的功能，它的基因转录产物必须经过多次酶剪切加工后形成成熟的MICRORNAS。过程如下最初的MICRORNAS经过RNA聚合酶Ⅱ转录后，首先形成初始MICRORNASPRIMICRORNAS，再经DROSHA剪切，变成前体RNICRORNASPREMICRORNAS，有其特有的发卡结构PREMICRORNAS从胞核转运至胞浆，此过程由EXPORTIN5参与，在胞浆中被DICER酶剪切，形成双链MICRORNAS分子最后，双链MICRORNAS分离，只有一条成为成熟的MICRORNAS，再与别的分子一起形成RNA诱导的沉默复合体RISC，RISC再通过与MRNA的3端非编码区相互作用，引起靶基因MRNA的降解或者翻译抑制，就是前面所讲在转录后负性调节蛋白质的表达。RNICRORNAS通过转录后负性调节目的蛋白质参与许多心血管疾病。我们通过升主动脉缩窄TRANSVERSEAORTACONSTRICTION，TAC对小鼠进行短期与长期的压力负荷，建立了心肌肥厚与心力衰竭的模型，同时对实验小鼠进行MIR455的上调，旨在探讨MIR455在压力负荷心肌肥厚中的细胞与分子学机制，为预防与治疗心肌肥厚提供新的思路。第一部分MIR455通过调控钙网蛋白促进短期压力负荷心肌肥厚的心肌细胞肥大目的最近研究显示，MICRORNAS与多种心血管疾病有关，但是迄今为止并没有MIRNA455MIR455与心肌肥厚的研究。我们通过小鼠升主动脉缩窄TRANSVERSEAORTACONSTRICTION，TAC2周建立了心肌肥厚的模型，旨在探讨MIR455在心肌肥厚中细胞与分子学机制。方法选用18只昆明种小鼠，随机分为手术结扎（升主动脉缩窄）MIR455为实验组TACMIR455，尾静脉注射包被MIR455的腺病毒，手术结扎GFP为阴性对照组TACGFP，尾静脉注射包被绿色荧光蛋白的腺病毒和假手术组SHAM，尾静脉注射包被绿色荧光蛋白的腺病毒。术后2周测量小鼠血流动力学及心脏超声数据对心肌组织进行HE和MASSON染色观察组织病理学变化应用QRTPCR方法检测肥大基因与纤维化基因的表达WESTEMBLOT分析凋亡蛋白QRTPCR与WESTERNBLOT分析MIR455的靶基因和蛋白。结果1、MIR455在小鼠体内的转染在尾静脉注射GFP的TAC后2周的小鼠体内MIR455有明显的降低，而经过尾静脉注射MIR455前体的TAC后2周的小鼠体内MIR455有明显的升高，TACGFP组与SHAM组相比较，TACMIR455组与TACGFP组相比较均具有统计学意义（P均＜001）。2、MIR455对TAC后2周小鼠血流动力学及心脏超声和组织病理学的影响2周时，经右侧颈动脉测压显示，同SHAM组比较，TAC小鼠BP和LVESP明显升高，其差值有统计学意义，但是同SHAM组比较，TAC2周时LVEDP无明显变化。2周时，TACGFP组与SHAM组比较，心肌细胞横截面积增大，心重体重比增加，LVAWD明显增加，LVIDD变小，EF增加，其差值有统计学意义（P＜005）。这些指标在TACMIR455组有了进一步的发展P＜005），如心肌细胞横截面积进一步增大，心重体重比，LVAWD，EF增加，LVIDD变小，但EF值2组无统计学意义P＞005）。3、MIR455对心肌肥厚基因的影响我们评估了基因转染后心肌肥厚基因ANF,ACTA1和MYH7的表达。2周时和SHAM组相比较，TACGFP组小鼠心肌组织中ANF,ACTA1和MYH7有明显增加P＜001），而且在TACMIR455组，ANF,ACTA1和MYH7的表达有进一步增加P＜001。4、MIR455对心肌纤维化的影响2周时通过MASSON染色，SHAM组可见少量胶原纤维散在分布于心肌细胞间隙中，呈现蓝色，心肌细胞呈红色，我们观察到TACGFP组和TACMIR455组较之于SHAM组心肌胶原纤维明显增加，但2者相比差异不明显。对于代表心肌纤维化的基因TGFΒ1和CTGF，较之于SHAM组，在TACGFP组和TACMIR455组的表达都有明显上升P＜005），但2者比较无明显差异P＞005）。5、MIR455对心肌细胞凋亡的影响WESTERNBLOT示2周时TACGFP组促凋亡蛋白BAX有明显上升，TACMIR455组变化不明显P＜005。TACGFP组和TACMIR455组抗凋亡蛋白BCL2有所下降，但两者比较无统计学意义P＞005）。6、在TAC导致的心肌肥厚中钙网蛋白是MIR455的TARGETGENE我们进行了CALR和GRP78基因与蛋白的检测，WESTERNBLOT分析，TACGFP组CALR和GRP78升高，但经过了MIR455的干扰，GRP78依然升高，而CALR却有了明显下降，说明CALR是MIR455的TARGETGENE之一。PCR示CALR下降同时也有CALRMRNA的下降，说明MIR455对CALR的调节是通过降低MRNA来抑制蛋白翻译。小结短期压力负荷后小鼠出现了代偿性心肌肥厚的特征，表现为心室壁的增厚，心室腔的缩小以及心脏收缩功能的增强，出现明显心肌细胞增大，病理学出现明显心肌细胞增大。伴随出现胎儿基因的重新激活。MIR455通过降解靶MRNA，CALR降低这条途径，使得心肌细胞进一步增大，心肌肥厚更加明显。第二部分MIR455通过调控钙网蛋白减轻长期压力负荷心肌肥厚小鼠的心肌纤维化和心肌凋亡目的心肌肥厚出现后，左心室重构进行性进展，会导致猝死、心力衰竭、心律失常等严重心脏事件。左室重构主要表现为心肌细胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌细胞（成肌纤维细胞），非细胞成分（胶原纤维）增加和心肌电生理以及代谢异常。我们构建了TAC后4周心力衰竭的小鼠，同时用MIR455进行干扰，以期了解MIR455对心肌纤维化和细胞凋亡的分子生物学影响及机制。方法本研究建立了TAC4周后的小鼠模型，并对MIR455进行于扰，测量小鼠血流动力学及心脏超声数据，对心肌组织进行HE和MASSON染色观察组织病理学变化应用PCR方法检测肥大基因与纤维化基因TUNEL法检测细胞凋亡，WESTEMBLOT分析凋亡蛋白PCR与WESTERNBLOT分析MIR455的TARGETGENE与蛋白表达。结果1、MIR455在小鼠体内的转染在尾静脉注射GFP的TAC后4周的小鼠体内MIR455有明显的降低，而经过尾静脉注射MIR455前体的TAC后4周的小鼠体内MIR455有明显的升高，TACGFP组与SHAM组相比较，TACMIR455组与TACGFP组相比较，均具有统计学意义（P均＜001）。2、MIR455对TAC后4周小鼠血流动力学及心脏超声的影响在TAC后的4周，与TAC后2周比较，虽然BP，LVESP,心重体重比及心肌细胞横截面积无明显变化，但观察到LVEDP增高，LVAWD变薄，LVIDD变大，EF下降P＜005），说明这些小鼠发生了明显的心肌重塑。但在TACMIR455组虽然LVAWD有所变薄（P＜005），但LVIDD并未见到明显的扩大P＞005），EF也无明显下降，也就是说，经过MIR455干扰的小鼠心肌依然保持着心肌肥厚的状态。这些结果暗示出MIR455可以阻止TAC4周后的心肌重塑。3、MIR455对心肌肥厚基因的影响4周时，和SHAM组相比较，TACGFP组和TACMIR455组小鼠心肌组织中ANF,ACTA1和MYH7有进行性上升（P＜005），但有一个现象值得注意，MYH7的表达在TACGFP组超过了TACMIR455组P＜001。4、MIR455对心肌纤维化的影响心肌组织切片MASSON染色显示SHAM组可见少量胶原纤维散在分布于心肌细胞间隙中，呈现蓝色，心肌细胞呈红色TACGFP组较之于SHAM组心肌胶原纤维明显增加，而TACMIR455组较之于TACGFP组心肌胶原纤维却有显著地减少。对于代表心肌纤维化的基因TGFΒ1和CTGF，虽然较之于SHAM组，在TACGFP组和TACMIR455组的表达都有明显上升，但在4周时，TGF1和CTGF在TACMIR455组的表达要低于在TACGFP组的表达（P＜001）。说明MIR455可以减轻TAC4周后的心肌重塑。5、MIR455抑制心肌细胞凋亡经过TUNEL染色，TACGFP组凋亡细胞明显增多，而TACMIR455组凋亡细胞较之于TACGFP组有明显下降。通过WESTERNBLOT分析，我们检测了抗凋亡蛋白BCL2与促凋亡蛋白BAX，结果显示，TACMIR455组较之于TACGFP组抗凋亡蛋白BCL2有显著上升，促凋亡蛋白BAX有明显下降。6、在TAC导致的心肌肥厚中钙网蛋白是MIR455的TARGETGENE我们进行了CALR和GRP78基因与蛋白的检测，WESTERNBLOT分析，TACGFP组CALR和GRP78升高，但经过了MIR455的干扰，GRP78依然升高，而CALR却有了明显下降，说明CALR是MIR455的TARGETGENE之一。PCR示CALR下降同时也有CALRMRNA的下降，说明MIR455对CALR的调节是通过降低MRNA来抑制蛋白翻译。小结长期压力负荷后小鼠出现了失代偿心衰的特征，表现为左室舒张末期压力的明显增高，因为心室腔出现扩大影响了心脏收缩功能，左室射血分数降低，出现明显心肌纤维化和心肌细胞凋亡，同时伴随纤维化基因与凋亡蛋白的改变。若长期上调MIR455，会降解靶RNRNA，使CALR降低，会减轻心肌纤维化及凋亡，减缓了心力衰竭的进程。结论在本研究中我们得到以下结论短期压力负荷后小鼠出现了代偿性心肌肥厚的特征，表现为心室壁的增厚，心室腔的缩小以及心脏收缩功能的增强，病理学出现明显心肌细胞增大。伴随出现胎儿基因的重新激活。MIR455通过降解靶MRNA，CALR降低这条途径，使得心肌细胞进一步增大，心肌肥厚更加明显。我们可以通过对MIR455进行调节来减轻心肌肥厚。长期压力负荷后小鼠出现了失代偿心衰的特征，表现为左室舒张末期压力的明显增高，心室腔扩大以及心脏收缩功能的降低，出现明显心肌纤维化和心肌细胞凋亡，同时伴随纤维化基因与凋亡蛋白的改变。上调MIR455降解靶MRNA，CALR降低，会减轻心肌纤维化及凋亡。因此在不同的时间段对MIR455进行不同的调控，可以减轻压力负荷导致心肌肥厚及延缓心力衰竭的进程。

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